Characterizing G-quadruplex formation : development and integration of novel assays
Caractérisation de la formation de G-quadruplex : développement et intégration de nouvelles méthodes
Résumé
Guanine-rich nucleic acid sequences can generate four-stranded, noncanonical secondary structures called G-quadruplexes (G4). G4 structures have been identified in the genomes of different species and are involved in physiological processes. Numerous putative G4 sequences (PQS) have been mined by G4 predicting algorithms and G4 chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq). However, finding a sequence relatively rich in guanines does not necessarily mean it can form a G4 structure. The main aim of this PhD thesis is to develop novel in vitro high-throughput G4 characterization assays, suitable for validating a vast amount of PQS identified by in silico G4 prediction methods and ChIP-seq. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is a powerful tool in characterizing intramolecular G4 structures that were dual-labeled by a chromophore (i.e. FAM) and a corresponding quencher (i.e. Tamra): at the low temperature, the two ends of the G4 are in close proximity and the FAM fluorescence is quenched via a FRET mechanism; with the temperature increasing, G4 unfolds and two ends are split apart, restoring gradually FAM fluorescence. Melting temperature (Tm) of a G4 structure could be calculated based on the FRET-melting curve. In this context, a new methodology called the FRET-melting competition (FRET-MC) assay has been developed, which allows to follow 48 duplicated samples within 2 hours. FRET-MC is based on the competitive binding of a selective G4 ligand (PhenDC3) between a labeled G4 reporter (FAM-Tel21-TAMRA, F21T) and an unknown competitor present in a large excess. PhenDC3 stabilizes the G4 structure of F21T and leads to an increase of the Tm of F21T of about 23 °C. An excess of G4 competitors can trap PhenDC3, leading to a decrease of the Tm of F21T back to the Tm value of F21T alone. In contrast non-G4 competitors have little influence on the F21T-PhenDC3 interaction. FRET-MC works well in most cases, but cannot be used to pick up G4s with low thermal stability, as these weak G4 behave as ssDNA at the temperature where F21T starts to melt. For this reason, an alternative isothermal FRET assay compatible with weakly stable G4s was developed. Iso-FRET exploits two labeled RNA probe strands: one of them 37Q (37-quencher) form a G4 thanks to the binding of PhenDC3, and the second one F22 (FAM-22) is partially complementary to 37Q. To this system an unlabeled competitor sequence is added. When the competitor is not a G4, PhenDC3 remains bound to 37Q and stabilizes its G4 structure, preventing duplex formation between 37Q and F22, allowing a high fluorescence signal of F22. On the contrary, an excess of a G4 competitor traps PhenDC3, which is no longer available to bind to 37Q, which in turns allows this oligonucleotide to hybridize to F22 resulting in fluorescence quenching. Iso-FRET can be performed at 25 °C and 37 °C (physiological temperature), which are acceptable to thermolabile G4 competitors. In parallel, a study focusing on the conformation of G4-prone GC-rich sequences which are rich both in cytosines and guanines was conducted. The structures of GC-rich sequences were dependent on cytosine content and [K⁺] / [Na⁺] ratio in buffer. Spectroscopic results shown that the G4 structure (CEB25) tolerates two three continuous cytosines tracks in potassium / sodium mixed buffers containing 40 mM or higher KCl concentration, implying that cytosine contained G4-forming sequences can still adopt a G4 structure in the intracellular environment. UV-melting results evidenced that the presence of cytosines in G4 loops does not decrease G4s stability, but rather increases the probability of forming a competing structure, either a hairpin or a duplex. As bioinformatics analysis indicates that the majority of cytosine-contained PQS located at pre-mRNAs, it will be interesting to transpose our experiments on DNA sequences to RNA motifs, in order to determine if the latter is more or less prone to hairpin / G4 competition.
Les séquences d'acides nucléiques riches en guanines peuvent adopter des structures secondaires non canoniques nommées G-quadruplexes (G4s). Ces structures ont été identifiées dans différents génomes et participent à de nombreux processus physiologiques. De nombreuses séquences G4s putatives (PQS) ont été identifiées par des analyses bioinformatiques et séquençage par immuno-précipitation de la chromatine (ChIP-seq). Par contre, trouver une séquence relativement riche en guanine ne signifie pas forcément qu'elle forme une structure G4. Le but de cette thèse se concentre sur le développement de nouvelles méthodes d'étude in vitro pour la caractérisation de G4s à haut débit, et la validation d'un grand nombre de PQS.Le transfert d'énergie par résonance de type Föster (FRET) est un puissant outil pour le suivi de la dénaturation d'un G4 intramoléculaire fonctionalisé aux extrémités avec deux sondes: un chromophore donneur (FAM) et un accepteur (TAMRA). À faible température, les deux extrémités sont à proximité, permettant la désactivation de la fluorescence du donneur par FRET. Quand la température augmente, le G4 est dénaturé et les deux extrémités s'éloignent, ce qui restaure graduellement la fluorescence du donneur. La température de dénaturation (Tm) peut être obtenue à partir de la courbe de FRET-melting. Une nouvelle méthodologie nommée FRET-melting compétitive (FRET-MC) a été développée, permettant de suivre 48 échantillons en duplica en 2 heures. Le FRET-MC se base sur la compétition d'un ligand sélectif pour les G4s (PhenDC3) entre un G4 reporteur (FAM-Tel21-TAMRA, F21T) et un compétiteur en large excès dont la structure est inconnue. L'interaction du PhenDC3 avec le G4 formé par F21T induit une stabilisation mesurée par l'augmentation du Tm d'environ 23°C. L'excès de compétiteur G4 va piéger le PhenDC3, ramenant le Tm de F21T à la valeur obtenue sans ligand. Une séquence compétitrice qui ne forme pas une structure G4 n'aura pas d'impact sur l'interaction du PhenDC3 avec F21T. Le FRET-MC est une méthode tolérant une grande variabilité de compétiteurs, excepté ceux présentant une faible stabilité thermique, qui se retrouvent sous forme monocaténaire à la température où F21T commence à se dénaturer. Le FRET isotherme (isso-FRET) a été développé comme une alternative compatible avec des G4s peu stables thermiquement. L'iso-FRET exploite deux RNAs : le 37Q (37-quencher) formant un G4 lorsque stabilisé par le PhenDC3, et le F22 (FAM-22) partiellement complémentaire à 37Q. À ce système est ajouté une séquence compétitrice non marquée. Si le compétiteur ne forme pas de G4, le PhenDC3 stabilise 37Q, empêchant son interaction avec F22, ce qui permet un fort signal de fluorescence de F22. Au contraire, un excès de compétiteur formant un G4 piégera le PhenDC3 qui ne sera plus disponible pour stabiliser 37Q. Il en résulte l'hybridation de 37Q avec F22, provoquant la désactivation de la fluorescence de F22. L'iso-FRET peut être utilisé à température 25°C ou physiologique (37°C), ce qui le rend compatible avec les compétiteurs G4s possédants une faible stabilité thermique. En parallèle, la conformation des séquences riches en CG formant des G4s a été réalisée. La structure des séquences riches en GC est étroitement liée au nombre de cytosines, mais également au ratio de [K⁺] / [Na⁺] présent dans le tampon. Les résultats spectroscopiques montrent que CEB25 tolère des boucles continues de cytosines dans un tampon mixte potassium / sodium. Cela implique que les séquences G4s riches en cytosine peuvent toujours adopter une structure G4 dans l'environnement intracellulaire. Les résultats d'UV-melting mettent en évidence que la présence de cytosines dans les boucles G4 ne diminuent pas leur stabilité, mais augmente la probabilité de former une tige-boucle ou un ADN palindromique bicaténaire en compétition. L'emplacement des PQS riches en cytosines a été étudié par analyse bioinformatique et indique une localisation au niveau des pré-ARNm.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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